Molecular Cloning, Co-expression and Characterization of dhaF and dhaG Genes Encoding Glycerol Dehydratase Reactivating Factor of Citrobacter freundii
弗氏柠檬酸菌甘油脱水酶激活因子基因的克隆、表达与功能鉴定

1,3-丙二醇是一种重要的化工原料,其生物法生产的研究逐渐受到的关注.研究以弗氏柠檬酸菌的总DNA为模板,通过PCR分别扩增出约1.8kb(dhaF)和0.4kb(dhaG)的两个基因片段分别编码甘油脱水酶激活因子大、小亚基,连接于pMD-18T载体,测序分析显示与GenBank中相关基因的相似性最高为86%.将两基因以多顺反子的方式与pSE380连接构建表达载体,并在大肠杆菌中进行高效表达,表达量占总蛋白的30%.将高效表达的激活因子用金属亲合层析和分子筛进行了纯化,得到电泳纯级的甘油脱水酶激活因子,SDS-PAGE分析显示:大、小亚基分子量约为63kDa和12kDa;非变性胶分析显示:全酶的分子量约为150kDa,经扫描分析推测甘油脱水酶激活因子很有可能是以α2β2方式结合的.以弗氏柠檬酸菌甘油脱水酶为研究对象,进行激活实验,结果证实该激活因子具备甘油脱水酶激活因子的功能,为进一步阐明甘油脱水酶的激活机制及1,3-丙二醇的高效生产奠定了基础.