Desarrollo y validación de una PCR múltiple para el diagnóstico de Bordetella spp. Desenvolvimento e valida o de uma PCR múltipla para o diagnóstico de Bordetella spp. Development and validation of a multiplex PCR for diagnosis of Bordetella spp.

El objetivo del trabajo consistió en dise ar y validar una PCR en formato convencional que permita confirmar la presencia o ausencia de Bordetella pertussis y detectar otras especies del género, como Bordetella parapertussis y Bordetella bronchiseptica, que pudieran estar involucradas en el cuadro clínico de coqueluche. A tal fin se dise ó una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) múltiple que amplifica una secuencia del promotor del gen de Toxina Pertussis y otra del gen de la Toxina Adenilato Ciclasa-Hemolisina. Se validó la metodología siguiendo esquemas publicados anteriormente. Se optimizaron las condiciones de la PCR. Se validó la metodología obteniéndose un límite de detección para ambas secuencias de 0,5 bacterias por reacción. Se validó, además, la especificidad y robustez de la técnica. Se presenta una nueva herramienta diagnóstica optimizada y validada, que permite detectar la presencia de las especies de Bordetella más frecuentemente involucradas en el cuadro clínico de coqueluche. Su uso combinado con alguna de las PCR habituales en diagnóstico, como la PCR IS481, permite aumentar la sensibilidad del diagnóstico de esta en-fermedad, la especificidad del mismo discriminando los resultados falsos positivos/negativos y aumentar el conocimiento sobre los agentes etiológicos implicados en esta patología. O objetivo do trabalho foi desenhar e validar uma rea o em cadeia da polimerase (PCR) em formato convencional que permita confirmar a presen a ou ausência de Bordetella pertussis e detectar outras espécies do gênero, como Bordetella parapertussis e Bordetella bronchiseptica, que pudessem estar envolvidas no quadro clínico de coqueluche. Para tal, foi desenhada uma PCR múltipla que amplifica uma sequência do promotor do gene de Toxina Pertussis e outra do gene da Toxina Adenilato Ciclase-Hemolisina. A metodologia foi validada seguindo esquemas publicados anteriormente. Foram otimizadas as condi es da PCR. Validou-se a metodologia obtendo-se um limite de detec o para ambas as sequências de 0,5 bactérias por rea o. Validou-se também a especificidade e robustez da técnica. Apresenta-se uma nova ferramenta diagnóstica otimizada e validada, que permite detectar a presen a das espécies de Bordetella mais frequentemente envolvidas no quadro clínico de coqueluche. Seu uso combinado com alguma das PCR habituais em diagnóstico, como a PCR IS481, permite aumentar a sensibilidade do diagnóstico desta doen a, a especificidade do mesmo discriminando os resultados falsos positivos/negativos e aumentar o conhecimento sobre os agentes etiológicos envolvido