过表达前列腺凋亡反应因子-4对NIT-1细胞的影响

目的：构建携带前列腺凋亡反应因子-4（prostateapoptosisresponse-4，PAR-4）基因PRKCapoptosisWT1regulator（pawr）表达的重组腺病毒载体，研究PAR-4对胰岛β细胞株NIT-1的影响。方法：利用OligoDesigner3.0设计Pawr模版引物，通过RT-PCR扩增出pawr基因片段，使用双酶切克隆至腺病毒载体ADV1，构建重组载体质粒pAdTrack-pawr-CMV。线性化pAdTrack-pawr-CMV和pAd-Easy-1共同转化到感受态大肠杆菌构建重组腺病毒载体质粒pAdTrack-pawr。将NIT-1细胞分为4组：低糖组、高糖对照组、低糖+PAR-4过表达组以及高糖+PAR-4过表达组，Westernblot检测各组PAR-4蛋白表达，MTT法检测各组细胞增殖能力，ELISA检测经葡萄糖刺激后的各组细胞胰岛素分泌功能。结果：克隆的pawr基因片段测序正确。高纯度质粒中量抽提试剂盒抽提重组腺病毒载体质粒成功，单酶切鉴定，质粒转染HEK293细胞后有GFP表达，扩增48h后出现细胞病变效应，病毒滴度测定为1×109pfu/ml，低糖和高糖过表达PAR-4后均较相应对照组PAR-4表达明显升高，高糖培养+过表达PAR-4组细胞增殖能力均较低糖（P=0.000）和高糖对照组细胞（P=0.000）明显下降，较低糖（P=0.003）和高糖对照组细胞（P=0.001）胰岛素分泌明显下降。结论：成功构建高滴度pawr基因表达的重组腺病毒载体并转染NIT-1细胞，转染PAR-4后高糖培养的NIT-1细胞增殖能力和胰岛素分泌功能明显下降。