应用pull-down方法检测草鱼恒定链(ii)与主要组织相容性复合体(mhc)分子的结合

？恒定链(invariantchain,ii)能结合主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex,mhc)ⅰ类和ⅱ类分子，并在mhc递呈抗原中起重要辅助作用。为了探讨鱼类ii和mhc分子体外结合关系，本研究采用pull-down方法检测草鱼(ctenopharyngodonidellus)ii与mhcⅰ类或ⅱ类分子的结合。克隆草鱼ii(711bp)、mhcⅰα(540bp)和mhcⅱβ(549bp)基因片段，再将其分别插入原核表达质粒pet-22b(无his标签)或pet-28a(含his标签)中，构建了3个重组质粒pet-22b-ii、pet-28a-mhcⅰα和pet-28a-mhcⅱβ。然后分别转染工程菌大肠杆菌(escherichiacoli)rosetta(de3)，进行诱导表达、纯化和聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis,page)鉴定。结果表明，含his标签的mhcⅰα和mhcⅱβ不仅表达，而且可高效纯化，其相对分子质量约为24kd；westernblot结果表明，ii可表达，相对分子质量约为30kd。将pet-22b-ii与pet-28a-mhcⅰα或pet-28a-mhcⅱβ分别共转染rosetta(de3)，构建了重组菌rosetta(de3)(pet-28a-mhcⅰα+pet-22b-ii)和rosetta(de3)(pet-28a-mhcⅱβ+pet-22b-ii)。经诱导表达和page检测发现，mhcⅰα和mhcⅱβ分别结合ii，形成相对分子质量为54kd的复合物；sds处理后，分别被解离形成单分子ii(30kd)以及mhcⅰα或mhcⅱβ(24kd)。在westernblot中，解离后的ii可与特异性多克隆抗体结合并被电化学发光(electrogeneratedchemiluminescence,ecl)显色。综上所述，草鱼ii可以分别与mhcⅱβ和mhcⅰα结合，为进一步研究动物ii与mhc分子的关系提供了基础资料。