新型双功能谷胱甘肽合成酶的真核和原核表达

摘要 通过裂解无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)菌体细胞得到基因组DNA。根据GenBank上已发表的无乳链球菌(菌种编号ATCC13813)新型双功能谷胱甘肽合成酶基因(gshF)的核酸序列与2种不同表达载体多克隆位点序列，分别设计引物F1、R1和F2、R2，再以总DNA为模板，经过特异性PCR扩增出长度约为2 200 bp的目的基因。随后分别对目的基因gshF和2种表达载体进行双酶切、连接等操作，得到表达载体pPIC9K-gshF与pET-gshF。用Sal I线性化表达载体pPIC9K-gshF后电转至毕赤酵母GS115中。经MD平板筛选重组子、菌落PCR鉴定阳性菌株、G418抗性梯度平板筛选多拷贝菌株，最终在4.0 mg·mL-1 G418抗性平板上筛选出阳性菌株。用甲醇终浓度为2%的BMMY培养基诱导该阳性菌株表达，每隔12 h取样并添加甲醇，96 h后离心收集发酵上清，经SDS-PAGE蛋白电泳显示：在85 kDa处出现1条明显蛋白带，大小与预期GshF蛋白一致。重组菌BL21-pET-gshF用IPTG诱导表达，先在37 ℃下培养90 min，再加入IPTG至1 mmol·L-1后诱导7 h，离心收集表达产物并对重组菌进行超声破碎处理后，进行SDS-PAGE蛋白电泳，同样在85 kDa处有1条蛋白带。采用Bradford法测定2种表达产物上清的蛋白量，其中重组酵母表达上清中蛋白量为0.46 mg·mL-1，重组大肠杆菌表达产物破壁后的蛋白量为1.46 mg·mL-1。测定并比较2种不同表达方式所得酶活，发现GshF在毕赤酵母表达中的比酶活仅为14.15 U·mL-1，经原核表达后比酶活可达62.15 U·mL-1