花斑裸鲤GeHSP70基因的克隆及其对重金属Cu2+胁迫的应答

【目的】克隆花斑裸鲤GeHSP70基因，并进行生物信息学分析；研究正常和Cu2+胁迫条件下GeHSP70的表达模式。【方法】采用分子生物学技术克隆花斑裸鲤GeHSP70基因的全长cDNA，分析其生物信息学特征。采用Real-time PCR技术分析正常和0.01 mg/L Cu2+胁迫（胁迫0，12，24，48 h）条件下GeHSP70 mRNA在花斑裸鲤肝脏、肾脏、脑和鳃4个组织中的表达情况，并采用ELISA试剂盒检测肝脏、鳃组织中GeHSP70蛋白的表达水平。【结果】花斑裸鲤GeHSP70序列共1 387 bp，由123 bp的5′-UTR、592 bp的3′ UTR和672 bp的编码区构成，编码223个氨基酸；GeHSP70蛋白是疏水性蛋白，分子质量为11.15 ku，等电点为5.01，包含2个HSP70家族的特征序列：IDLGTTYS（11-18位氨基酸）和IFDLGGGTFDVSIL（199-212位氨基酸）。GeHSP70基因核苷酸序列与鲫鱼的同源性最高（93%），在系统进化树中与同科或属中鱼种聚合成一个分支，显示出高度保守性。Real-time PCR结果表明，正常条件下花斑裸鲤GeHSP70在鳃组织中的表达量最高，其次是肝脏，在脑和鳃组织中表达量较低；随着0.01 mg/L Cu2+胁迫时间的延长，花斑裸鲤肝脏、肾脏和鳃组织的GeHSP70mRNA表达量先升后降，在24 h表达量最高，而脑组织的表达量持续升高；GeHSP70在花斑裸鲤肝脏和鳃组织的蛋白水平表达量总体均表现为先升后降，表明Cu2+能够诱导GeHSP70的表达。【结论】成功克隆了花斑裸鲤GeHSP70 cDNA全长，在0.01 mg/L Cu2+胁迫下花斑裸鲤GeHSP70在mRNA水平和蛋白水平呈规律性应答，表明GeHSP70是潜在的反映水环境质量的生物标志物