Detection of Yersinia pestis sRNA by digoxigenin-labeled Northern blot
地高辛标记的Northern blot检测鼠疫菌sRNA

摘要:【目的】随着高通量测序方法的应用，越来越多的sRNA(small non-coding RNA，sRNA)需验证。本研究建立用地高辛标记Northern blot检测鼠疫菌sRNA的技术，为细菌sRNA 验证提供一种灵敏、特异的方法。【方法】在低铁条件下，提取鼠疫菌总RNA，10% dPAGE分离后电转到尼龙膜上并用紫外线交联RNA。膜经地高辛标记RyhB1或RyhB2寡核苷酸RNA探针过夜杂交后洗脱、封闭和免疫检测，最后曝光显影。【结果】地高辛标记的Northern blot曝光时间为20 s－3 min，RyhB1或RyhB2检测灵敏度分别为0.005 μg和 0.05 μg。RyhB1或RyhB2探针特异性好，相互间无交叉反应。带正电或中性的尼龙膜都适用于杂交反应。RNA 探针在42℃－65℃内杂交均可，提高温度可减少非特异性反应;而DNA 探针杂交温度需摸索。【结论】本研究成功构建一种地高辛标记Northern blot检测鼠疫菌sRNA技术，具有特异性好、灵敏度高、探针易保存、曝光时间短等优点，为细菌sRNA验证和功能研究提供有利工具。