西花蓟马化学感受蛋白的cDNA克隆、时空表达分析及组织定位

【目的】研究西花蓟马Frankliniellaoccidentalis化学感受蛋白（chemosensoryproteins,CSPs）在其嗅觉及化学感受系统中的作用。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆西花蓟马化学感受蛋白基因，用DNAMAN软件进行序列分析，使用BLAST进行同源性比较，采用MEGA6的Neighbor-joining法构建了进化树。通过实时定量PCR(real-timequantitativePCR,qRT-PCR)检测了西花蓟马不同发育期以及成虫不同组织（触角、头、足、胸、腹）中该基因的表达谱。免疫新西兰大白兔制备了FoccCSP1蛋白抗体，与样品切片中FoccCSP1蛋白以及10nm胶体金颗粒偶联的羊抗兔二抗反应，经透射电镜观察，对该蛋白在西花蓟马成虫组织中进行免疫定位。【结果】克隆并鉴定了一个西花蓟马化学感受蛋白基因，命名为FoccCSP1（GenBank登录号：KM527949）。该基因cDNA序列全长597bp，完整开放阅读框（ORF）288bp，编码95个氨基酸，成熟蛋白分子量11.377kD，等电点4.72，具有化学感受蛋白典型的4个保守半胱氨酸位点特征。FoccCSP1与东亚飞蝗LocustamigratoriaLmigCSP（GenBank登录号:CAJ01476.1）的氨基酸序列一致性最高，进化关系最近。FoccCSP1在西花蓟马不同发育阶段和成虫不同组织中均有表达，在羽化1d的雌虫中相对表达量最高，其次是2龄若虫，蛹和成虫后期表达量最低；在触角和足中相对表达量较高。成功构建了重组表达质粒pET-30a/FoccCSP1,并诱导表达，经Ni柱纯化，获得目的蛋白；免疫定位表明，该蛋白在西花蓟马触角、足、头等部位血淋巴中均大量存在。【结论】明确了西花蓟马化学感受蛋白基因FoccCSP1的核苷酸、氨基酸序列特征。FoccCSP1广泛分布在西花蓟马多个组织及各个发育期，据此推测该基因可能在西花蓟马嗅觉识别、感受机械刺激以及调节生长发育等方面扮演重要角色。