甜菜夜蛾拓扑异构酶I氨基酸突变对其DNA解旋活性的影响

【目的】为了探究甜菜夜蛾Spodopteraexigua拓扑异构酶I（topoisomeraseI,TopI）氨基酸突变对其DNA解旋活性的影响。【方法】通过克隆甜菜夜蛾TopI基因，构建原核表达载体，采用完全重叠PCR定点突变技术，向甜菜夜蛾TopI的V420,L530,A653和S729（根据人TopI氨基酸序列编号）4个位点引入突变，将改造成功的重组TopI基因转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，诱导重组蛋白表达、纯化，测定TopI突变对其解旋活性的影响。【结果】完全重叠PCR能实现甜菜夜蛾TopI定点突变。重组蛋白在体外得到稳定的表达，表达产物经SDS-PAGE电泳分析在96.0kDa处出现特异性条带。通过对重组蛋白分离纯化并测定对质粒pBR322解旋酶活性，发现引入V420I,L530P和A653T突变后TopI的比活力显著降低，而引入S729T突变后比活力与野生型蛋白无显著差异。【结论】本研究证明在甜菜夜蛾TopI中引入V420I,L530P和A653T突变后，其对底物pBR322的解旋活性显著降低，为后期探索甜菜夜蛾TopI的定点突变与其对喜树碱及其衍生物敏感性的关系奠定了基础。