绵羊cyp19基因卵巢启动子的克隆及其表达活性研究

？本研究旨在克隆绵羊cyp19基因卵巢启动子序列片段，构建真核表达载体，并在细胞水平检测其组织特异性表达情况。参考已知序列设计特异性引物，pcr扩增绵羊cyp19基因卵巢启动子1.1和0.5kb两个片段，并与已公布的序列进行同源性比较；将测序正确的两个片段分别定向克隆到去除cmv的pegfp-n2载体骨架中，构建真核表达载体pcyp19-1.1-egfp-n2和pcyp19-0.5-egfp-n2，重组质粒在脂质体lipofectaminetmltx+plus介导下，分别转染绵羊的颗粒细胞和胎儿成纤维细胞，并于转染后24、48和72h观察egfp表达情况。结果表明，扩增获得片段与已公布序列高度同源；应用转录因子结合位点预测软件对所得序列分析表明，该扩增片段含有类似于tata-box核心启动顺式元件，并含有多个潜在转录因子的结合位点。转染24h后，发现pcyp19-1.1-egfp-n2在颗粒细胞可观测到绿色荧光表达，48h荧光细胞数量有所增加；转染72h时荧光细胞数最多；在胎儿成纤维细胞也有少量egfp基因表达。pcyp19-0.5-egfp-n2在颗粒细胞和成纤维细胞中均未检测到荧光。结果表明，扩增所得的绵羊cyp19基因卵巢启动子1.1kb片段可引导外源基因在颗粒细胞中的表达，可用于与繁殖相关的基因功能及转基因动物研究，但并非卵巢特异性启动子。